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非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等變性劑的條件下, 對保持活性的蛋白質(zhì)進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,常用于同工酶的鑒定和提純.未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝膠電泳可以使生物大分子在電泳過程中保持其天然的形狀和電荷,它們的分離是依據(jù)其電泳遷移率的不同和凝膠的分子篩作用,因而可以得到較高的分辨率,尤其是在電泳分離后仍能保持蛋白質(zhì)和酶等生物大分子的生物活性,對于生物大分子的鑒定有重要意義,其方法是在凝膠上進行兩份相同樣品的電泳,電泳后將凝膠切成兩半,一半用于活性染色,對某個特定的生物大分子進行鑒定,另一半用于所有樣品的染色,以分析樣品中各種生物大分子的種類和含量.
實驗方法:
非變性聚丙烯酰胺凝膠和變性sds-page電泳在操作上基本上是相同的,只是非變性聚丙烯酰胺凝膠的配制和電泳緩沖液中不能含有變性劑如SDS等.
一般蛋白進行非變性凝膠電泳要先分清是堿性還是酸性蛋白.分離堿性蛋白時候,要利用低pH凝膠系統(tǒng),分離酸性蛋白時候,要利用高pH凝膠系統(tǒng).
酸性蛋白通常在非變性凝膠電泳中采用的pH是8.8的緩沖系統(tǒng),蛋白會帶負電荷,蛋白會相陽極移動;而堿性蛋白通常電泳是在微酸性環(huán)境下進行,蛋白帶正電荷,這時候需要將陰極和陽極倒置才可以電泳分離酸性蛋白.
工作液配制:
1.40%膠貯液(Acr:Bis=29:1);
2.4×分離膠Buf(1.5 M Tris-HCl,pH 8.8):18.2 g Trisbase 溶于ml 水,用濃HCl調(diào)pH 8.8,加水定容到100ml,4℃貯存;
3. 4×堆積膠Buf(0.5 M Tris-HCl,pH 6.8):6g Trisbase 溶于80ml 水,用濃HCl調(diào)pH 6.8,加水定容到100ml,4℃貯存;
4.10×電泳Buf(pH8.8 Tris-Gly):30.3 g Trisbase, 144g 甘氨酸,加水定容到L,4℃貯存;
5.2×溴酚藍上樣Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl,3.0ml甘油,.2ml 0.5% 溴酚藍,5.5ml dH2O;-20℃貯存;
6. 10％APS;
7. 0.25％考馬斯亮藍染色液:Coomassie blue R-250 2.5g,甲醇ml,HAc 100ml, dH2O 450ml;
8.考馬斯亮藍脫色液:100ml甲醇,100冰醋酸,800ml dH2O
電泳膠的配制及電泳條件(上槽電極為負,下槽電極為正):
1. 堿性非變性膠 17%分離膠(10 ml) 4%堆積膠(5 ml)
2. 40%膠貯液(40%T,3.3%C) 4.25ml 0.5ml
3. 4×分離膠Buf(1.5 M Tris-HCl,pH 8.8)2.5ml
4. 4×堆積膠Buf(0.5 M Tris-HCl,pH 6.8) 1.25ml
5. 水 3.2ml
6. 10％APS 35ul
7. TEMED 15 ul
8. 10×電泳Buf(pH8.8 Tris-Gly):100ml稀釋到L
電泳條件:100V恒壓約20min,指示劑進入濃縮膠;改換160V恒壓,當指示劑移動到膠板底部時,停止電泳,整個過程約80min.
染色和脫色:取出膠板于0.25％考馬斯亮藍染色液中染色約30min,傾出染色液,加入考馬斯亮藍脫色液,緩慢搖動,注意更換脫色液,直至膠板干凈清晰背景.也可以用銀染或者活性染色.
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