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試劑準(zhǔn)備區(qū)

該實(shí)驗(yàn)區(qū)主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。

試劑和用于標(biāo)本制作的材料應(yīng)直接運(yùn)送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。

試劑準(zhǔn)備區(qū)配備有2~8°C冰箱和-80°C冰箱，計(jì)算冷負(fù)荷時(shí)，需要將它們計(jì)算在內(nèi)。

房間的面積宜控制在15m2~20m2。本區(qū)的壓力梯度要求為:相對(duì)正壓狀態(tài)，以防止外界含核酸氣溶膠的空氣進(jìn)入，造成污染。

標(biāo)本制備區(qū)

該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為臨床標(biāo)本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測(cè)定RNA時(shí)cDNA的合成。

標(biāo)本制備區(qū)配備有2~8°C冰箱和-20°C冰箱，計(jì)算冷負(fù)荷時(shí)，需要將它們計(jì)算在內(nèi)。在標(biāo)本制備區(qū)，還需要配備生物安全柜，用于進(jìn)行提取核酸的操作。

為避免提取的核酸在柜內(nèi)反復(fù)循環(huán)，造成標(biāo)本之間的交叉污染，出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，該區(qū)域配備的生物安全柜必須是B2型的。生物安全柜工作區(qū)垂直氣流全部來自實(shí)驗(yàn)室，排風(fēng)經(jīng)過高效過濾器過濾后直接排至室外，不允許回到安全柜和實(shí)驗(yàn)室中。

根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，如果實(shí)驗(yàn)室內(nèi)配備生物安全柜，每配備一臺(tái)，實(shí)驗(yàn)室的面積增加10m2;標(biāo)本制備區(qū)的面積宜在25m2~30m2之間。本區(qū)的壓力梯度要求為:相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)檎龎海员苊鈴泥徑鼌^(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。

擴(kuò)增室

該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為DNA或cDNA擴(kuò)增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。

在巢式PCR測(cè)定中，通常在擴(kuò)增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險(xiǎn)性，加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。

擴(kuò)增室主要配備PCR實(shí)驗(yàn)室的核心儀器PCR儀，本文實(shí)例中使用了ABI7500和ABI9700兩種PCR儀。

在實(shí)驗(yàn)室建造過程中，需要給PCR儀配備專門的UPS電源，以保證其正常工作。該區(qū)面積控制在15m2~20m2。

本區(qū)的壓力梯度要求為:相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動(dòng)。個(gè)別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。建議采用5~10Pa壓差，在控制上比較容易實(shí)現(xiàn)。

產(chǎn)物分析區(qū)

該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為擴(kuò)增片段的測(cè)定。如使用全自動(dòng)封閉分析儀器檢測(cè)，此區(qū)域可不設(shè)。

在室內(nèi)配備通風(fēng)櫥，保證房間內(nèi)的相對(duì)負(fù)壓，空氣從室外流向室內(nèi)。該區(qū)面積控制在15m2~20m2。

本區(qū)是主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，因此對(duì)本區(qū)的壓力梯度的要求為:相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至其它區(qū)域。建議采用5~10Pa壓差，在控制上比較容易實(shí)現(xiàn)。